β-nikotiinamiidi mononukleotiidi (NMN) tootmine Escherichia colis

Abstraktne

Suhkurtõbi on krooniline ja progresseeruv haigus, mille levimus pidevalt suureneb, kasvav finantssurve kogu maailmas olevatele tervishoiusüsteemidele. Hiljuti raviti NAD ⁺ prekursor P-nikotiinamiidi mononukleotiidiga (NMN) ravitud hiirtel insuliiniresistentsust, mis on II tüüpi diabeedi tunnusjoon, toksilisi toimeid pole täheldatud. Kuid NMN-l on kõrge hinnasilt, vaja on kulutõhusamaid tootmismeetodeid. Selles uuringus pakutakse välja biotehnoloogilise NMN tootmise meetod Escherichia coli piirkonnas . Näitame, et rekombinantse nikotiinamiidi fosforibosüültransferaasi (Nampt) ja fosforibosüülpürofosfaadi (PRPP) süntetaasi bitsistrooniline ekspressioon nikotiinamiidi (NAM) ja laktoosi juuresolekul võib olla edukas strateegia NMN tasuva tootmise jaoks. Valgu ekspressioonivektorid, mis kannavad Haemophilus ducreyi geeni NAMPT ja L135I mutatsiooniga Bacillus amyloliquefaciens'i PRPP süntetaasi, transformeeriti Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Nendes rakkudes, mida kasvatati PYA8 söötmes, millele oli lisatud 0,1% NAM ja 1% laktoosi, jõudis NMN tootmine maksimaalselt 15,42 mg-ni bakterikultuuri liitri kohta (või 17,26 mg-ni grammi valgu kohta).

Sissejuhatus

Rahvusvahelise Diabeediföderatsiooni andmetel oli 2017. aastal II tüüpi diabeediga täiskasvanute arv 425 miljonit ja 2045. aastaks on see oodata 649 miljonit. Ülemaailmselt kulutatakse tervishoiu eelarvest 12% (ehk 727 miljardit dollarit). diabeedi ravimise kohta. Värsked uuringud seostasid insuliiniresistentsust, II tüüpi diabeedi tunnust, mitokondrite funktsiooni languse ja NAD ⁺ taseme langusega ning NAD ⁺ / NADH suhtega, mida täheldati ka vananemisel. NAD ⁺ on kõigis elusorganismides ja on oksüdatsiooni-redutseerimise reaktsioonides hästi tuntud koensüüm. NAD ⁺ -sõltuvad valgu deatsetülaasid nagu SIRT1 ja SIRT6 toimivad metaboolsete sensoritena ja reguleerivad alamjooksu teid, mis lõpuks taastavad mitokondrite funktsiooni ja insuliinitundlikkuse. See leid laiendab NAD ⁺ mõju uurimisvaldkonda teistele vananemisega seotud degeneratiivsetele haigustele, näiteks: südame-veresoonkonna, vähk, artriit, osteoporoos või Alzheimeri tõved.

Β-nikotiinamiidi mononukleotiid (NMN) on NAD ⁺ biosünteesi vaheühend, mis on toodetud nikotiinamiidist (NAM) ja fosforibosüülpürofosfaadist (PRPP) nikotiinamiidi fosforibosüültransferaasi ensüümi (Nampt) abil (EC 2.4.2.12). Kuna NMN oli hästi talutav ja sellel ei olnud täheldatud kõrvaltoimeid pikaajalisel manustamisel hiirtele ja vanusega seotud füsioloogilise languse ennetamisel, osutus NMN tõhusaks rasvasisaldusega dieedist põhjustatud II tüüpi diabeedi ravis, muutes vananemisega seotud mitokondriaalse düsfunktsiooni ja päästades neuraalsete tüvirakkude vanusega seotud languse mõju.

NAM muundatakse tavaliselt NMN-ks NAD ⁺ päästeteedes osalevate ensüümide abil, näiteks Nampt. Selle ensüümi toime moodustab rakus peamise NAD ⁺ anaboolse aktiivsuse. Imetajate või mikroorganismide nukleotiidide metabolismi ja biosünteesi reguleerimine toimub tavaliselt PRPP tarbimisega. PRPP tuleneb riboos-5-fosfaadist pentoosfosfaadi raja nii oksüdatiivsete kui ka mitteoksüdatiivsete harude kaudu.

Bakterites muundatakse NAM kõige sagedamini nikotiinamidaasiks nikotiinhappeks (NA), mis on integreeritud Preiss-Handleri rajale, see kehtib ka Escherichia coli kohta . Imetajatel nikotiinamidaasi aktiivsust ei täheldatud; Selle asemel muundatakse NAM ühe NAM fosforibosüültransferaasi ensüümi abil NMN-ks. Ehkki enamikul bakteritest puudub NAM fosforibosüültransferaas, ekspresseeritakse ensüümi Haemophilus ducreyi ja Shewanella oneidensis .

Biotehnoloogias kasutatakse soovitud ensümaatilise aktiivsusega valkude kontrollitud ekspressiooniks sageli lihtsaid ja metaboolselt mitmekülgseid organisme, näiteks Escherichia coli . Selliseid ensüüme kodeeriv DNA sisestatakse bakteritesse sageli ekspressioonivektorite, näiteks Novagen'i pET-süsteemi abil. PET vektorid transformeeritakse bakterites, mis ekspresseerivad T7 RNA polümeraasi, näiteks E. coli BL21 (DE3). Ensüümide ekspressioonikontroll saavutatakse lac- promootori abil, mis lülitab ekspressiooni sisse ainult laktoosi (mis metaboliseeritakse ka süsinikuallikana) või selle sünteetilise struktuurianaloogi, isopropüül-1-tio-β-D-galaktopüranosiidi (IPTG) juuresolekul ( ei metaboliseeru, püsiv kontsentratsioon kasvamise ajal). Kuna bakterite metabolism on mitmekülgne, on süsinikuallika varieeruvus ja söötmega täiendatud ensüümsubstraatide kontsentratsioon peamised tegurid, mida tuleb biotehnoloogilises protsessis arvesse võtta.

Püüdes käsitleda NMN-i praegust kõrge hinnaprobleemi, pakkusime oma eelmises töös välja puhastusmeetodi bakterirakkudest. Protsessi edasiseks optimeerimiseks, kuna suutsime leida ainult ühe avaldatud pärmi valmistamismeetodi, pakub see uuring välja lihtsa ja kulutõhusa NMN biotehnoloogilise tootmismeetodi Escherichia colis .

Tulemused

Bakteriaalne transformatsioon

Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 ja Nampt pärit Mus musculus oletatava NadV jaoks genereeritud mitme aminohappejärjestuse joondamine näitab suurt sarnasust (joonis S1), muutes kõik need ensüümid kandidaatideks biotehnoloogiliseks protsessiks.

Muudetud E. pET28a (+) plasmiididega kantud nadV (NAMPT) geenidega coli rakud moodustasid kanamütsiiniga täiendatud LB Agari plaatidel kolooniaid. Transformeerimata bakterirakkudega inokuleeritud plaatidel kolooniaid ei tuvastatud. Nendest kolooniatest eraldatud plasmiidse DNA agaroosgeeli elektroforees kinnitas Nampt-PET28a, pET28a-soNadV või pET28a-hdNadV plasmiidide esinemist E-s . coli DH5a (täiendav joonis S2A, rada 2, 3, 4). DNA-ribad sobisid E- st pärit ribadega. coli BL21 (DE3) pLysS rakud (lisa Joonis S2A, rada 6, 7, 8), mis transformeeriti vastavate plasmiididega, mis olid ekstraheeritud otse E-st . coli DH5a. Transformeerimata E. Negatiivse kontrollina kasutatud coli BL21 (DE3) pLysS rakud, pLysS plasmiidi olemasolu kinnitati elektroforeesiga, agaroosgeelil näidati riba, mis vastab teadaolevale pikkusele 4886 aluspaari (täiendav joonis S2A, rada 5).

(Rohkem eksperimentaalseid andmeid leiate algselt veebisaidilt: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)